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β-内醯胺抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸类似，其末端的氨基酸吸附在正在形成的肽聚糖的前兆NAM-NAG肽单元上。β内醯胺抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合。β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合。这个不可逆的结合使得青霉素结合蛋白无法链接正在形成的肽聚糖层。此外这个结合还可能激活细胞壁中的自溶酶。
β-内醯胺抗生素有一个β-内酰胺环之结构。这些抗生素的效应取决于它们是否能够完整地达到青霉素结合蛋白以及是否能与青霉素结合蛋白结合。因此细菌有两种抵抗β-内醯胺抗生素的方法。
第一个抵抗方法是使用酶水解β-内酰胺环。通过生产β-内酰胺酶等酶，细菌可以解开抗生素中的β-内酰胺环，使得抗生素失效。这些酶的基因可能本身就在细菌的染色体上，也可能通过质粒交换而获得，例如新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）。其基因表现可能是在接触抗生素后开始的。
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